实验材料
0.1M氯化钙溶液（200ml，灭菌后4℃备用）
LB培养基（200ml锥形瓶，每瓶100ml）
100%甘油（50ml，灭菌）
1.5ml离心管（灭菌）
操作板（-20℃预冷）
200μl枪头（灭菌，-40℃预冷）
操作步骤
1
提前一晚将菌种接种到1ml的LB培养基，过夜培养。
2
将过夜培养的菌液加入到100ml的LB培养基，培养至OD₆₀₀=0.6。
3
预冷离心机到4℃，将菌液5000g离心10分钟收集到50ml离心管中。
4
吸干上清，将沉淀用20ml 0.1M的预冷氯化钙溶液重悬，然后4℃ 5000g离心10分钟。
5
重复第4步3次，最后加入20ml 0.1M的预冷氯化钙溶液重悬并冰浴30分钟。
6
4℃ 5000g离心10分钟，在冰上吸干上清，向5ml 0.1M的预冷氯化钙溶液中加250μl甘油混匀配制成储存液，将储存液用冰水预冷后全部用于重悬细菌沉淀。
7
将1.5ml离心管放冰上预冷（或者预冷金属操作板），用预冷的200μl枪头按100μl/管分装感受态。分装完毕后标记好放-80℃冰箱备用。
⚠️ 从第6步开始感受态细胞需全程保持低温，一旦升温就会失效。
⚠️ 低温特别重要，各种要用的耗材都需要提早预冷，制备分装时候，最好两个人一起做，一个人分，一个盖上ep管，立刻冻存。
流程示意图
菌种接种
过夜培养
扩大培养至OD₆₀₀=0.6
4℃离心收集菌体
氯化钙溶液重悬洗涤（3次）
⚠️ 冰浴30分钟
制备甘油储存液重悬
分装（100μl/管）
-80℃冻存备用